本研究的目的是探讨在9-14岁青春期前女孩接种2剂HPV-16/18AS04-佐剂疫苗后，或在15-25岁妇女接种3剂后，在首次接种疫苗后的3年内（HPV-研究）和5年内（HPV-研究），对31型和45型非疫苗人乳头瘤病毒的长期交叉免疫反应性。研究结果显示，在第一次给药后5年内，两种方案都会产生抗HPV-31和HPV-45的抗体。青春期前女孩的抗体浓度与妇女相似。36个月时，各组对HPV-31和HPV-45的特异性CD4+T细胞和B细胞应答相似。
关键词：HPV-16/18AS04-佐剂疫苗，HPV-31，HPV-45，交叉反应性，非疫苗类型，免疫原性
AS04-佐剂的人类乳头瘤病毒16和18型疫苗（下文简称AS04-HPV-16/18）是在0、1和6个月时按照3剂量计划开发和最初授权交付的。AS04是一种含有吸附在铝盐（μgAl3+）上的3-O-脱酰基-4’-单磷酰脂A（50μg；GSK）的佐剂。由于观察到在9-14岁女孩中给予3次接种剂量后疫苗的高疫原性，因而产生了该年龄组在第0个月和第6个月2次剂量方案的更深一步研究并最终获得许可。探索性1/2期HPV-研究（临床试验注册号NCT）的目的是调查9-25岁受试者AS04-HPV-16/18的替代时间表。验证性3期HPV-研究（临床试验注册号NCT），旨在证明青春期前女孩（9-14岁）的2剂量方案（0月和6月）与妇女（15-25岁）的3剂量方案（0月、1月和6月）的免疫应答的非劣效性，其中HPV-16/18AS04-佐剂疫苗在治疗宫颈上皮内瘤样病变3级或更高级别的疗效先前已得到证实。
HPV-16和HPV-18是致宫颈癌最常见的病毒类型,大约有70%宫颈癌的病例中可以检测到其核酸片段。另外，HPV-31和HPV-45也是高危HPV类型，它们导致了大约10%的宫颈癌的发生。在针对3剂AS04-HPV-16/18接种方案的疗效和免疫原性研究表明，它对包括HPV-31和HPV-45在内的非疫苗型HPV也具有一定程度的保护（交叉保护）和免疫原性（交叉反应性）作用。近期随访研究提供的证据显示，接种3次AS04-HPV-16/18后，可获得长期的交叉保护效果。除了典型的疫苗类型（如HPV-16/18），HPV-和HPV-系列研究还评估了2剂疫苗后AS04–HPV-16/18对非疫苗HPV类型31和45的细胞和体液免疫原性。在本篇报道中，我们将揭示HPV-和HPV-研究中的HPV-31和HPV-45免疫原性结果，以及HPV-研究中的细胞免疫应答。
方法和入选人群
实验设计、入选人群和伦理
HPV-（临床试验注册号NCT）研究是一项于年10月至年3月在加拿大和德国21个中心进行的1/2期、部分盲法、对照、随机（1:1:1:1）平行组试验。研究HPV-（临床试验注册号NCT）是年6月至年11月在5个国家（加拿大、德国、意大利、台湾和泰国）进行的一项3B期、多中心、开放、随机试验。
这些研究所采取的研究方法在既往报道中已经描述和发表过[1，2]。我们对这两项研究中的一部分受试者进行了分析评估。所有参与HPV-试验的受试者并在规定时间点提供样本的受试者入选本研究。在HPV-研究中，来自各自预选地点的每个年龄层（9-11岁、12-14岁、15-19岁和20-25岁）的前50名受试者入选本研究。体液免疫亚群的受试者与HPV-研究中细胞介导免疫亚群的受试者相同。在HPV-研究中，免疫原性数据在首次接种后5年内进行评估；在HPV-研究中，免疫原性数据在首次接种后3年内进行评估，并同时评估细胞免疫反应。
这两项初步研究均获得合适的独立伦理委员会或机构审查委员会批准，并遵循赫尔辛基宣言的原则、参考良好的临床实践指南和根据所有其他监管要求进行。在研究开始之前，所有参与者和/或父母或法定代表人都获得了书面知情同意。
免疫原性评估
我们从所有受试者在第一次疫苗接种前（第0个月）、第7、12、18、24和36个月以及第48和60个月（仅在HPV-研究中）中采集血液样本进行抗体测定。如前所述，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）评估HPV-31和HPV-45的抗体滴度[7]。我们定义血清转化率（血清阳转）为在接种前对HPV-31和HPV-45血清阴性的受试者中，血清抗体效价大于或等于59ELISA单位/mL的临界值。
参照其他试验相关研究方法，HPV-研究中，通过细胞内细胞因子染色测定HPV-31和HPV-45特异性的CD4+T细胞应答。依据既往研究方法，B细胞对HPV-31和HPV-45的反应通过B细胞酶联免疫吸附斑点试验进行评估。
统计方法
对36个月（HPV-研究）和60个月（HPV-研究）免疫原性方案组群（ATP-I）的最初血清阴性参与者进行描述性初步分析。对基于总接种组群（TVC)进行二次免疫原性分析，用以补充ATP分析。该分析是对HPV-研究的探索性分析，并同时对HPV-研究进行了事后验证分析。ATP-I包括的所有可评估参与者，这些参与者符合所有资格标准、遵守研究程序以及可获得关于免疫原性终点测量数据。
几何平均浓度（GMC）的计算采用对数浓度转换平均值的反对数。在接种前后，以95%置信区间(CIs)精确计算每个抗原和GMC的血清转化率。在GMC计算中，对于低于检测截止值的抗体浓度，取一半的临界值。
结果
研究人群
在HPV-研究中，名受试者接受了至少1剂疫苗，并被纳入TVC。这其中，包括3剂量AS04-HPV-16/18接种方案的名15-25岁的参与者（和82名9-14岁的参与者）和2剂量AS04-HPV-16/18接种方案的78名9-14岁的参与者（和名15-25岁的参与者）。其他参与者（n=）接受了不同的疫苗剂量、剂型。3剂量接种组有91名年龄在15-25岁的受试者，2剂量接种组有46名年龄在9-14岁的受试者被纳入第60个月的ATP-I；其中37名和33名受试者分别被考虑用于HPV-31和HPV-45亚组分析。
总的来说，名参加HPV-TVC的参与者（93.7%）接种了AS04–HPV-16/18，并完成了第36个月随访。其中，36个月ATP-I队列共例（93.8%）：包含15-25岁的3剂量接种方案组例，9-14岁的2剂量接种方案例[2]。在这些参与者中，分别有92人和96人被考虑进行HPV-31和HPV-45亚群分析。
补充表1显示基于年龄和研究分层，两组的人口统计学特征和基线血清学状况。
对HPV-31和HPV-45的免疫反应
所有来自HPV-研究的血清阴性受试者在最后一次接种AS04-HPV-16/月后（第7个月；补充表2）HPV-31andHPV-45抗体转阳；除1例以外的所有来自HPV-研究血清阴性参与者（3剂量接种方案组）在最后一次接种AS04-HPV-16/月后HPV-31andHPV-45抗体转阳。在60个月HPV-ATP-I组群里，HPV-31和HPV-45阳性率在接种2剂量和3剂量接种方案的人群中的比例相似：大约90%的受试者HPV-31呈血清阳性，80.0%的受试者HPV-45呈血清阳性。同样，在第36个月ATP-I组群里，，大约80%的接种者对HPV-31和HPV-45呈血清阳性，而与组别无关。
在这两项研究中，HPV-31和HPV-45抗体接在种后第7个月出现峰值反应，GMC在第24个月开始达到平稳期，并持续到第60个月（结果依据HPV-研究）（图1）。接受2剂量方案的青春期前女孩的HPV-31/45抗体的GMC与接受3剂量方案的年轻成年妇女相似（补充表3）。
结果TVC值与ATP-I值一致（数据未显示）。
HPV-31和HPV-45特异性B细胞和T细胞应答
在疫苗接种后检测到HPV-31和HPV-45特异性记忆B细胞和T细胞应答，各组间的应答相似（图2和补充表4）。在TVC中发现与上述结果类似的结果（未显示数据）。
讨论
在这两项研究中，与接受3剂量接种方案的年轻成年妇女相比，接受2剂量方案的青春期前女孩中观察到类似的抗-HPV-31和抗-HPV-45GMCS和血清转化率，无论接受的方案如何，接种后最初出现血清阴性血清转化的受试者占80.0%以上。在两个试验中观察到的31型和45型非疫苗HPV抗体的动力学与HPV-16和HPV-18的动力学相似：在最后一次疫苗剂量后出现峰值反应，随后出现平稳，没有减弱免疫原性的迹象。正如预期的那样，在相似的时间点，HPV-31和HPV-45的GMC似乎低于HPV-16和HPV-18的GMC，尽管不同类型的GMC不应直接比较，因为它们是使用不同任意单位的单独分析结果（补充表5）。
HPV-31和HPV-45特异性CD4+T细胞和记忆性B细胞应答在HPV-研究结束前即第36个月仍能检测到，并且各组的检测范围相似。这表明，在初次接种后的几年内，无论是2剂量还是3剂量方案，无论是疫苗防疫后还是自然感染后，都有能力产生抗HPV-31和HPV-45的抗体。这些发现并不令人惊讶，因为HPV-31与HPV-16密切相关，HPV-45与HPV-18密切相关。然而，在另一项研究中，将AS04-HPV-16/18与纯铝佐剂HPV疫苗进行比较，发现AS04佐剂疫苗的交叉反应幅度要大得多。因而，我们有理由认为佐剂在非疫苗型抗人乳头瘤病毒抗体的产生过程中扮演重要角色。
总的来说，这些结果提供了额外的证据，即无论是2剂还是3剂AS04-HPV-16/18疫苗接种方案，对HPV-31和HPV-45都有交叉保护；而无论是2剂还是3剂AS04-HPV-16/18疫苗接种方案，这种交叉保护都似乎是长期存在的。
我们目前的工作有一个局限性，即由于所研究人群的年龄较小，因此在免疫原性评估的同时没有评估疗效终点。然而，已有临床试验[6]和有效性/影响研究[8-11]报道显示了3剂AS04-HPV-16/18接种方案对HPV-31和HPV-45以及其他HPV类型的长期交叉保护作用。我们的研究结果表明，在青春期前女孩中接种2剂疫苗后，可能会有类似的结果。
总之，随着时间的推移，HPV-31和HPV-45的交叉反应活性保持，并且在青春期前女孩接种2剂AS04-HPV-16/18或妇女接种3剂后，交叉反应性相似。在疫苗接种后5年内观察到的GMC平稳期和记忆B细胞的存在，进一步证明了2剂AS04–HPV-16/18对非疫苗类型31和45的交叉保护是持久的。
图1样本来自36个月（HPV-研究）和60个月（HPV-研究）免疫原性方案组群的最初血清阴性参与者，在每个特定的时间点，通过酶联免疫吸附试验测定人类乳头瘤病毒31型（HPV-31；A）和HPV-45型（B）几何平均浓度（GMCS）。CI，置信区间；2D，AS04佐剂HPV-16/18疫苗的2剂量接种方案；3D,AS04佐剂HPV-16/18疫苗的3剂量接种方案。第0个月的GMC相当于检测截止值的一半（29.5单位/ml）。
图2人类乳头状瘤病毒31型（HPV-31）–特异性（A）和HPV-45–特异性（A）CD4+T细胞应答HPV31–特异性（C）和HPV-45–特异性（D）记忆B细胞应答。样本来自HPV-研究的最初血清阴性受试者36个月免疫原性方案组群。框的上限和下限表示四分位范围，框内的水平线和条表示中间值，箱线表示最大值和最小值。2D，AS04佐剂HPV-16/18疫苗的2剂量接种方案；3D,AS04佐剂HPV-16/18疫苗的3剂量接种方案。
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